MEPS a jeho použití při přípravě vzorků v pivovarské analytice

Významnou úlohu při stanovování senzoricky aktivních látek v pivu zaujímá plynová chromatografie. Před vlastním plynově chromatografickým stanovením je však nutné stanovované látky vyextrahovat, zakoncentrovat a eventuálně přečistit. Za tímto účelem byla během posledních dvaceti let vyvinuta řada technik pro přípravu vzorků, které mohou nahradit dosud používané klasické postupy. Tyto postupy zahrnují off-line a on-line metody a jsou založeny jak na důkladné extrakci látek, tak na principech ustanovení rovnováhy. Tato práce se zabývá popisem nového postupu známého pod označením MEPS (microextraction by packed sorbent) a jeho možného použití v pivovarské analytice.

1 ÚVOD

Příprava vzorku představuje důležitý krok v celém procesu analýzy vzorku. Jejím cílem je účinným způsobem vyextrahovat stanovované látky z matrice, odstranit interference, popřípadě zlepšení chromatografických vlastností sledovaných analytů. Z celého analytického procesu je příprava vzorků většinou krokem, který je časově nejnáročnější, nejpracnější a také je nejnáchylnější ke vzniku chyb.

Současné snahy vědeckých týmů jsou zaměřeny zejména na miniaturizaci a zkrácení doby nutné pro přípravu vzorku, aby se celý analytický proces urychlil. Hlavními cíli při vývoji těchto postupů bylo, a stále zůstává, zvýšit kapacitu laboratoře pro dané stanovení, celkově zlepšit kvalitu přípravy vzorků, dosáhnout lepších detekčních limitů, snížit množství vzorku nutného k provedení analýzy, minimalizovat použití organických rozpouštědel a sorbentů a v konečném výsledku tak snížit i množství odpadu (1, 2).

Jedním z těchto významných postupů je i metoda extrakce na pevné fázi (SPE). Tato technika byla představena před více než dvaceti lety a s úspěchem nalezla uplatnění při stanovení široké škály látek v mnoha matricích, včetně piva (vyšší aromatické alkoholy, iso-α-hořké kyseliny, mastné kyseliny, furfural, hydroxymethylfurfural, vicinální diketony, polyfenoly, ATNC, chlorfenoly, umělá sladidla) (3-14).

Před analýzou je nutné SPE kolonku nejprve kondicionovat. Poté se kolonkou prosaje vzorek, obvykle okolo 10–50 ml, rychlostí několika ml/min. Pak se kolonka propláchne několika mililitry vody a vysuší se jemným proudem dusíku za laboratorní teploty. Nakonec jsou zachycené analyty desorbovány malým množstvím (okolo 100–500 μl) organického rozpouštědla a analyzovány na plynovém chromatografu nebo jsou po převedení do vhodného rozpouštědla, většinou mobilní fáze, nastříknuty na kolonu kapalinového chromatografu (1).

S nápadem zminiaturizovat tento postup přišel Mohamed Abdel-Rehim z farmaceutické společnosti AstraZeneca (15). Mikroextrakce na pevném sorbentu – MEPS (microextraction by packed sorbent) je novým typem SPE postupu. Miniaturizuje objem extrahovaného vzorku na množství 10 – 250 μl. Komerčně dostupný MEPS je nabízen se stejnými sorbenty jako konvenční SPE kolonky, takže se většina SPE metod dá převést na tento postup. Většina dosud publikovaných aplikací MEPS se týká především analýzy léčiv a jejich metabolitů v moči, krvi a plasmě (16).

Předložená práce se zabývá popisem tohoto postupu známého pod označením MEPS a jeho možným využitím v pivovarské analytice.

2 MEPS

2.1 Uspořádání

Základem je plynotěsná skleněná stříkačka o objemu 100–250 μl. Sorbent může být umístěn ve stříkačce a pomocí dvou polypropylenových filtrů o velikosti částic 20 μm je udržován u ústí stříkačky. Jinou možností je umístění sorbentu do malého lože, které se umístí mezi tělo stříkačky a jehlu stříkačky. MEPS se na trh dodává od firmy SGE Analytical Science, Melbourne, Austrálie (17).

2.2 Druhy sorbentů

Volba vhodného sorbentu je velice důležitá, má-li být dosaženo uspokojivého přečištění extraktu a výtěžnosti stanovovaných analytů. Z tohoto důvodu je nutné zvážit vlastnosti analytů – jsou polární, nepolární nebo ionizované? Podle toho je také nutné optimalizovat podmínky.

Dosud se v postupu MEPS používali tyto sorbenty: silika (C2, C8, C18), kationtový iontoměnič s aktivními skupinami benzensulfonové kyseliny, polymer (polystyrenové částice), MIP sorbenty (navázané skupiny zajišťujícími reakce přímo na sorbentu), organické monolitické sorbenty (19).

Aby se zabránilo vysokému zpětnému tlaku, používají se relativně velké částice podobně jako v konvenční SPE, kde se velikost částic sorbentu pohybuje mezi 40–60 μm (18). Množství použitého sorbentu se pohybuje v rozsahu 1–2 mg.

2.3 Kondicionace sorbentu

Obyčejně se sorbent zvlhčí promytím 50 μl methanolu a následně 50 μl vody nebo 0,1% kyseliny mravenčí. Tento krok aktivuje sorbent a zajistí reprodukovatelné zachycení sledovaných analytů. Z praktických důvodů se pro kondicionaci sorbentu používá stejný roztok jako pro promývání sorbentu (19).

2.4 Aplikace vzorku

Extrakce probíhá pomalým (20 μl/s) natažením 25 až 250 μl vzorku do stříkačky. Tím je dosaženo dobré perkolace vzorku skrz lože sorbentu. Vzorek může být natahován a vystřikován ze stříkačky i několikrát, pokud je to nutné. Opakovaným pumpováním vzorku do stříkačky a ze stříkačky dochází k zakoncentrování analytů na sorbentu (19).

2.5 Promytí sorbentu

Pro promývání se nejčastěji používá voda o objemu 50 až 250 μl. Často se používá voda obsahující 0,1% kyselinu mravenčí. Promývání se doporučuje provádět rychlostí 50 μl/s. Pokud je zapotřebí, lze tento krok opakovat, ale může to mít negativní dopad na výtěžnost. Z toho důvodu je nutné podmínky MEPS zoptimalizovat (19).

2.6 Eluce analytů

Vzhledem k tomu, že se používá jen velmi malé množství sorbentu, desorpce analytů se provádí rovněž relativně malým množstvím elučního rozpouštědla, např. 50 μl methanol-voda 95:5. Během tohoto kroku je výhodné stříkačku zahřívat na teplotu 40 °C, což podpoří účinek methanolu (19).

2.7 Rekondicionace sorbentu

Sorbent se rekondicionuje zpravidla vypráním pomocí 250 μl elučního rozpouštědla a poté 250 μl rozpouštědla použitého k promytí sorbentu. V některých případech je možné cyklus tohoto promývání opakovat až pětkrát.

2.8 „Carry-over“ efekt

Carry-over je problém, jehož nebezpečí se objevuje zejména u automatizovaných systémů. Je limitujícím faktorem v případě stopové analýzy, negativně ovlivňuje přesnost a opakovatelnost při validaci metody. Technika MEPS však používá velmi malého množství sorbentu, které může být snadno a účinně „vypráno“, a tak se možnost přenosu látek mezi vzorky snižuje na minimum. Navíc tuto rekondicionaci sorbentu je možné provést v době, kdy se předcházející vzorek měří na chromatografu. Pokud se mezi extrakcemi vzorků sorbent promyje elučním a pak promývacím roztokem pětkrát za sebou, carryover efekt se sníží na méně než 0,1 % (20).

2.9 Výhody MEPS

Cílem vývoje nových technik je automatizace a zvýšení průchodnosti laboratoře. Tento požadavek metoda MEPS splňuje. Využití metody MEPS je výhodné z několika důvodů: jde o jednoduchý postup, dá se online automatizovat (některé autosamplery, např. CTC-Pal, plně podporují techniku MEPS), proces přípravy vzorku je rychlý, cena analýzy je ve srovnání s tradiční SPE metodou minimální.

Automatizace není jedinou velkou předností MEPS metody. Extrakce z mnohem menších objemů vzorku, malá množství rozpouštědel a malý mrtvý objem systému společně s rychlostí a jednoduchostí – to vše patří k dalším nesporným výhodám tohoto postupu přípravy vzorku. Další významnou skutečností je fakt, že eluční objem svou velikostí je vhodný k přímému nástřiku do plynového nebo kapalinového chromatografu (16).

3 MEPS A PIVOVARSKÁ ANALYTIKA

Jak bylo uvedeno v Úvodu, metoda extrakce na pevné fázi se používá v celé řadě pivovarských analýz. V naší laboratoři byla zatím zkušebně otestována možnost použití techniky MEPS pro stanovení nižších volných mastných kyselin. Postup vycházel z postupu popsaného Hage a později Horákem (7,21), pouze byla minimalizována množství vzorku a použitých rozpouštědel.

Kondicionace byla provedena 30 μl methanolu a následně 30 μl ultračisté vody. Poté bylo MEPS stříkačkou pětkrát nasáto a vystříknuto 100 μl vzorku. Vysušení sorbentu C18 bylo provedeno třikrát 100 μl suchého vzduchu. Nakonec byly látky eluovány 10 μl chloroformu.

Poté byly 2 μl chloroformového extraktu nastříknuty na kolonu plynového chromatografu. K separaci byla použita 10 m dlouhá křemenná kapilární kolona DB-Wax firmy J&W Scientific s vnitřním průměrem 0,18 mm a tloušťkou filmu 0,18 μm. Kolona byla temperována na 120 °C po dobu 2 min, poté následoval teplotní gradient 10 °C/min do teploty 150 °C a následně 30 °C/min až do teploty 200 °C. Při této teplotě kolona zůstala po dobu 15 min. Nástřik byl prováděn ve splitless módu, split ventil byl otevřen po 0,5 min. Injektor i plamenoionizační detektor byly vyhřáty na teplotu 250 °C. Jako nosný plyn bylo využito helium v kvalitě 5.0, tlak na kolonu byl 210 kPa při 75 °C. Výsledný chromatogram je uveden na obr. 1.

Obr. 1 Chromatografický záznam stanovení volných mastných kyselin po extrakci metodou MEPS. 1 – isomáselná kyselina, 2 – máselná kyselina, 3 – isovalerová kyselina, 4 – valerová kyselina, 5 – kapronová kyselina, 6 – heptanová kyselina, 7 – kaprylová kyselina, 8 – kaprínová kyselina, 9 – undekanová kyselina, 10 – laurová kyselina, 11 – tridekanová kyselina, 12 – myristová kyselina, 13 – pentadekanová kyselina, 14 – palmitová kyselina.

Z tohoto úvodního pokusu je zřejmé, že postup MEPS je použitelný i v pivovarské problematice. Dalším cílem tedy bude optimalizace a validace MEPS metody pro stanovení různých senzoricky aktivních látek v pivu. Přesnost a opakovatelnost celého postupu je možné ještě zvýšit použitím elektronické, automatické stříkačky eVol, kterou speciálně pro MEPS aplikace od loňského roku dodává firma SGE Analytical Science.

4 ZÁVĚR

Technika MEPS se vzhledem k výše uvedeným výhodám jeví jako rovnocenná alternativa k jiným postupům (např. mikroextrakce na pevné fázi – SPME, sorpční extrakce na míchací tyčince – SBSE), které významným způsobem přispívají k zefektivnění přípravy vzorku. Lze tedy očekávat rozšíření aplikací do oblasti životního prostředí, analýzy potravin včetně pivovarské oblasti.